Cepas chilenas de origen clínico de Vibrio cholerae no-O1, no-O139 portan los genes vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF del sistema de secreción T3SS2 presentes en una isla de patogenicidad / Chilean strains of clinical origin of non-O1, non-O139 Vibrio cholerae carry the genes vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF from secretion system T3SS2 present in an island of pathogenicity

Resumen Introducción. Los factores de virulencia de las cepas de Vibrio cholerae no-O1, no-O139 no son claramente conocidos. La cepa de origen septicémico NN1 Vibrio cholerae no-O1, no-O139 fue secuenciada previamente mediante la plataforma Illumina, detectándose en su genoma un fragmento de la isla de patogenicidad VPaI-7 de V. parahaemolyticus. Objetivo: detectar los genes de virulencia vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF en cepas chilenas clínicas de V. cholerae no-O1, no-O139. Material y Métodos: Un total de 9 cepas chilenas de origen clínico de Vibrio cholerae no-O1, no-O139 aisladas entre 2006-2012 fueron analizadas mediante ensayos de reacción de polimerasa en cadena (RPC, en inglés PCR) convencional para los genes de secreción tipo III codificados en dicha isla: vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF. Adicionalmente se determinó la presencia de los genes de virulencia hylA y rtxA. Además, se realizaron ensayos de repetitive element palindromic PCR (REP-PCR) y Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR). Resultados: la mayoría (6/9) de las cepas chilenas de V. cholerae no-O1, no-O139 contiene todos los genes de secreción tipo III vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF, codificados en una isla de patogenicidad. Además, el total de las cepas (9/9) contiene los genes de virulencia hylA y rtxA. Conclusión: Estos resultados sugieren fuertemente la posibilidad que dichas cepas posean un potencial de virulencia importante en seres humanos.

Backgound: The virulence factors of the Vibrio cholerae non-O1, non-O139 strains are not clearly known. The strain of septicemic origin NN1 Vibrio cholerae non-O1, non-O139 was sequenced previously by the Illumina platform. A fragment of the pathogenicity island VPaI-7 of V. parahaemolyticus was detected in its genome. Aim: To detect the virulence genes vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF in Chilean strains of V. cholerae non-O1, non-O139. Methods: A total of 9 Chilean strains of clinical origin of Vibrio cholerae non-O1, non-O139 isolated between 2006-2012 were analyzed by conventional PCR assays for type III secretion genes encoded on that island: vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 and vopF. Additionally, the presence of the virulence genes hylA and rtxA was determined. In addition, REP-PCR and ERIC-PCR assays were performed. Results: most (6/9) Chilean V. cholerae non-O1, non-O139 strains contain the type III secretion genes vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 and vopF, encoded in an island of pathogenicity. In addition, all (9/9) the strains contain the virulence genes hylA and rtxA. Conclusion: These results strongly suggest the possibility that those strains possess an important virulence potential in humans.

Caracterización de los mecanismos de resistencia a azoles en aislados clínicos chilenos de Candida albicans / Characterization of azole resistance mechanisms in Chilean clinical isolates of Candida albicans

Introduction: The commensal yeast Candida albicans, can cause superficial or systemic candidiasis in susceptible hosts. In Chile, azole antifungals are the most widely used drugs in the treatment of candidiasis. In a previous study performed at our center, 2.1 and 1.6% of clinical isolates of C. albicans were found to be resistant to fluconazole and voriconazole, respectively. Objective: To characterize the resistance mechanisms involved in azoles resistance in Chilean clinical isolates. Methodology: Eight resistant, nine susceptible-dose dependent (SDD) and 10 susceptible strains (n: 27) were selected according to the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-S3 criteria, from vaginal and urine samples. Mutations in the 408-488 region of the ERG11 gene were studied by sequencing, and the relative expression of ERG11 gene and efflux pump genes CDR1, CDR2 and MDR1, was evaluated by quantitative real-time PCR (q-PCR). Results: No mutations were detected in the ERG11 gene and its overexpression was found only in 12.5% of the resistant strains (1/8). The most prevalent mechanism of resistance was the over-expression of efflux pumps (62.5%; 5/8). Conclusion: The study of the expression of efflux pumps by q-PCR could be a useful diagnostic tool for early detection of azole resistance in C. albicans.

Introducción: Candida albicans es una levadura comensal capaz de causar una infección oportunista en hospederos susceptibles denominada candidiasis, que puede ser superficial o sistémica. En Chile, los antifúngicos más utilizados para el tratamiento de las candidiasis son los azoles. En un estudio previo en nuestro centro, se detectó que 2,1 y 1,6% de cepas clínicas de C. albicans fueron resistentes a fluconazol y voriconazol, respectivamente. Objetivo: Caracterizar los mecanismos de resistencia involucrados en la resistencia a azoles en cepas clínicas chilenas. Metodología: Según los criterios del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-S3, se seleccionaron ocho cepas resistentes, nueve cepas susceptibles dosis dependiente (SDD) y 10 cepas sensibles (n: 27), aisladas de flujo vaginal y orina. Se evaluó la presencia de mutaciones en la región 408-488 del gen ERG11 por secuenciación y la expresión relativa del gen ERG11 y de los genes de bombas de eflujo CDR1, CDR2 y MDR1 por RPC en tiempo real cuantitativa (q-PCR). Resultados: No se encontraron mutaciones en el gen ERG11 y la sobre-expresión de éste sólo se presentó en 12,5% de las cepas resistentes (1/8). El mecanismo prevalente en la cepas resistentes fue la sobre-expresión de bombas de eflujo encontrándose en 62,5% de las cepas resistentes (5/8). Conclusión: El estudio de la expresión bombas de eflujo por q-PCR podría ser una herramienta diagnóstica útil para la detección temprana de resistencia a azoles en C. albicans.

Formación y regeneración de protoplastos de phaffia rhodozyma / Formation and regeneration of phaffia rhodozyma protoplasts

En este trabajo se describe la preparación y regeneración de protoplastos a partir de cultivos frescos de la levadura carotenogénica phaffia rhodozyma, en forma eficiente y con un alto grado de rendimiento en la sobrevida de las células tratadas. Para ello se han realizado una serie de experimentos para formar protoplastos de p.rhodozyma, utilizando tres cepas silvestres y cinco cepas afectadas en carotenogénesis. Se probó las enzimas bioglucanasa, biocelulasa, bioxilanasa, glucoronidasa, zimoliasa 100T, lisozima y novozima 234, encontrándose que novozima 234, es la que tiene mayor eficiencia. En las cepas silvestres UCD 67-210 y UCD 67-385 y las cinco cepas de color, se logra un 100 porciento de protoplastos entre 60 a 90 minutos de tratamiento con novozima a 37ºC. Sin embargo, no fue posible formar protoplastos en ninguna de las condiciones estudiadas con las cepas silvestres UCD 67-383. Tales resultados pueden ser devidos a diferencias en la pared celular entre dichas cepas. Además, se ha observado que la incubación a 37ºC reduce notablemente la sobrevida de las células tratadas. Para la formación y regeneración de protoplastos se utilizó una serie de condiciones, encontrando que un sorbitol 0.2 M la destrucción de las células es menor que a concentraciones de sorbitol 0.8 y 1 M. Sin embargo, el medio más adecuado para la formación y regeneración de los protoplastos debe contener KC1 0.8 M como agente osmolar, manteniendo la isotonía del medio y logrando que la destrucción celular sea menor

Presencia de plasmidos de DNA de doble hebra en phaffia rhodozyma / Presence of double stranded plasmid DNA in phaffia rhodozyma

El análisis mediante electroforesis en gel de agarosa, de los ácidos nucleicos de tres cepas silvestres de phaffia rhodozyma, permitió determinar la presencia de elementos genéticos extracromosómicos de DNA de doble hebra en una de ellas, la cepa UCD 67-210. Esta cepa es portadora de al menos 6 bandas de DNA cromosómico y cuyos tamaños moleculares corresponden a 6.5, 5.9, 5.0, 4.4, 3,2 y 2.5 kb. Con el objetivo de determinar el tipo de ácido nucleico que constituye estos elementos, se estudió su comportamiento frente a diferentes nucleasas. El tratamiento con ribonucleasa A, ya sea en alta o baja fuerza iónica, no tiene efecto sobre las bandas electroforéticas, así como el tratamiento con nucleasa SI. Por el contrario, el tratamiento con desoxiribonucleasa pancreática conduce a una degradación completa de las bandas y del DNA cromosómico. Estos resultados sugieren que la naturaleza química de los plásmidos corresponde a DNA de doble hebra. Por otra parte, la visualización de los plásmidos en gel de agarosa, depende de la utilización de proteinasa K y SDS en el procedimiento de purificación de los plásmidos y en las condiciones de corrida electroférica, sugiriendo la presencia de un complejo DNA plásmidial-proteína en cada uno de estos elementos. Finalmente, el análisis mediante enzimas de restricción de dos de estos plásmidos, sugiere que estos elementos no están relacionados